Параллельное восстановление доступности хроматина и динамики экспрессии генов из замороженных регуляторных Т-клеток человека

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 5506 (2023) Цитировать эту статью

1369 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Эпигенетические особенности, такие как доступность ДНК, диктуют регуляцию транскрипции в зависимости от типа и состояния клеток, и картирование этого в зависимости от здоровья и болезни в клинически значимом материале открывает двери для новых механистических представлений и новых целей для терапии. Анализ секвенирования доступного транспозазы хроматина (ATAC-seq) позволяет определять профиль доступности хроматина на основе низкого количества клеток, что делает его поддающимся анализу на популяциях редких клеток, таких как регуляторные Т-клетки (Treg). Однако мало что известно о совместимости анализа с криоконсервированными популяциями редких клеток. Здесь мы демонстрируем надежность протокола ATAC-seq, сравнивая первичные клетки Treg, полученные из свежих или криоконсервированных образцов РВМС, в устойчивом состоянии и в ответ на стимуляцию. Мы расширяем этот метод, чтобы изучить возможность проведения одновременного количественного определения доступности хроматина и транскриптома из одной аликвоты 50 000 криоконсервированных клеток Treg. Параллельное профилирование доступности хроматина и экспрессии генов в одном и том же пуле клеток контролирует клеточную гетерогенность и особенно полезно, когда оно ограничено ограниченным исходным материалом. В целом мы наблюдали высокую корреляцию моделей доступности и динамики факторов транскрипции между свежими и криоконсервированными образцами. Кроме того, очень похожие транскриптомные профили были получены из целых клеток и из супернатантов, полученных в результате реакций ATAC-seq. Мы подчеркиваем возможность применения этих методов для описания эпигеномного ландшафта клеток, извлеченных из биохранилищ криоконсервации.

Экспрессия генов регулируется путем связывания факторов транскрипции (ТФ) с проксимальными промоторами и дистальными регуляторными элементами, такими как энхансеры. Структура хроматина оказывает большое влияние на экспрессию генов, контролируя доступ ТФ к сайтам связывания в этих энхансерах и промоторах1. Локализованные паттерны эпигенетической модификации хроматина, такие как модификация гистонов, метилирование ДНК и ремоделирование нуклеосом, коррелируют с активностью энхансера, связыванием TF и ​​регуляцией транскрипции. Доступность хроматина связана со степенью, в которой белки способны физически взаимодействовать с хроматином, и находится под сильным влиянием эпигенетических модификаций, расположения нуклеосом и белков, связывающих хроматин, которые ограничивают доступ к ДНК2. Более доступный или открытый хроматин связан с транскрипционно-активными областями и регуляторными элементами, тогда как закрытый хроматин связан с молчащими или репрессированными областями. Например, хотя доступная ДНК составляет ~ 2–3% генома, она захватывает более 90% областей, занятых ТФ, исследованных в проекте ENCODE2,3,4. Доступность хроматина обычно определяют экспериментально по восприимчивости хроматина к ферментативному метилированию или расщеплению. Однако традиционные методы профилирования хроматина, такие как DNase-seq, требуют миллионов клеток в качестве входных данных и включают сложный рабочий процесс подготовки библиотеки. Анализ доступного транспозазы хроматина с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq) представляет собой относительно новый полногеномный подход, который одновременно исследует структуру хроматина (доступность и расположение нуклеосом) и, что немаловажно, связывание TF с высоким разрешением и меньшими входными требованиями, чем другие методы5,6 . Разработка ATAC-seq позволила количественно оценить доступность хроматина, используя гораздо меньшее количество клеток, что делает его пригодным для клинических условий и представляющих интерес популяций редких клеток. Измерение доступности хроматина с разрешением одной клетки также стало возможным с разработкой стратегий секвенирования одноклеточного ATAC (scATAC-seq)7,8,9. В ATAC-seq транспозаза Tn5, предварительно загруженная адаптерами секвенирования следующего поколения, одновременно разрезает и лигирует адаптеры секвенирования в доступных открытых областях хроматина5,6. Захваченные фрагменты между адаптерами затем можно амплифицировать с помощью ПЦР и подвергнуть высокопроизводительному секвенированию5,6.