Набор векторов и штаммов для хромосомной интеграции делящихся дрожжей

Том 13 научных докладов, номер статьи: 9295 (2023) Цитировать эту статью

Подробности о метриках

Экспрессия гетерологичных генов является важным методом генетики дрожжей. У делящихся дрожжей гены leu1 и ura4 использовались главным образом в качестве селектируемых маркеров гетерологичной экспрессии. Чтобы расширить репертуар маркеров селекции, доступных для гетерологичной экспрессии генов, мы разработали новые системы вектор-хозяин, использующие lys1 и arg3. Применяя редактирование генома с помощью системы CRISPR/Cas9, мы выделили несколько аллелей lys1 и arg3, каждый из которых имеет критическую мутацию в области ORF. Параллельно мы разработали набор векторов, которые дополняют аминокислотную ауксотрофию мутантов lys1 и arg3 при интеграции в каждый локус. Используя эти векторы в сочетании с ранее разработанным интеграционным вектором pDUAL, мы успешно наблюдали локализацию трех белков в клетке одновременно путем слияния их с различными флуоресцентными белками. Таким образом, эти векторы обеспечивают комбинаторную экспрессию гетерологичных генов, что позволяет решить все более разнообразные экспериментальные задачи.

Изучение биологии дрожжей стимулировало разработку сложных экспериментальных систем для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе множества биологических явлений. В последнее время для более глубокого изучения этих молекулярных механизмов иногда требуются сложные экспериментальные системы. Во многих случаях такой сложный эксперимент требует экспрессии нескольких трансгенов в клетке. С этой целью было разработано несколько векторов, которые можно использовать в качестве эписомальных плазмид или интегративных векторов, а также конститутивных или индуцируемых промоторов1, 2. Предпочтительны системы экспрессии, которые могут воспроизводить условия, аналогичные физиологическим средам. В этом смысле использование интегративных векторов является одной из передовых систем, используемых в биологии дрожжей, а не эписомальных векторов3.

Ранее мы разработали два типа эписомальных векторов, которые также можно использовать для хромосомной интеграции путем рекомбинации с одним кроссовером4, 5. Один тип вектора предназначен для интеграции либо в локусы lys1, arg1, либо his3. Когда эти векторы успешно интегрируются в целевые локусы, трансформанты становятся ауксотрофными по отношению к соответствующим аминокислотам. Достоинство этих векторов состоит в том, что их можно использовать для штаммов, не имеющих аминокислотной ауксотрофии. Следовательно, во многих случаях эти векторы можно использовать без подготовки нового штамма-хозяина. Однако тот факт, что интеграция векторов в геном приводит к ауксотрофии аминокислот, в некоторых случаях является недостатком. С другой стороны, векторы серии pDUAL предназначены для интеграции в локус leu14. Хотя их можно использовать только для штаммов, имеющих аллель leu1-32, трансформанты становятся прототрофными по лейцину, что позволяет легко отбирать трансформанты (рис. 1). Тот факт, что векторы pDUAL не содержат функциональной копии гена leu1, позволяет избежать отбора трансформантов, в которых плазмиды случайно интегрированы в геном. Хотя оба типа векторов имеют свои преимущества и недостатки, векторы типа pDUAL кажутся более полезными с точки зрения отбора и поддержания подходящих трансформантов.

Интеграция pDUAL в геном мутанта leu1-32. Векторы серии pDUAL содержат часть гена leu1, содержащую сайты узнавания фермента рестрикции в области ORF leu1. Когда рекомбинация одиночного кроссовера происходит после точки мутации аллели leu1-32, ожидается, что результирующий геном будет иметь две копии leu1, одна из которых лишена 3'-части, а другая представляет собой полноразмерный функциональный ген. Схема не в масштабе.

В этой статье, принимая во внимание стратегию одиночной кроссоверной рекомбинации типа pDUAL, мы попытались разработать новые системы вектора-хозяина, нацеленные на локусы, отличные от leu1. Используя недавно разработанную систему CRISPR/Cas9 в делящихся дрожжах6, мы успешно выделили штаммы с критическими мутациями сдвига рамки считывания в lys1 или arg37,8. Мы также сконструировали векторы, которые могли бы дополнять аминокислотную ауксотрофию этих мутантов при целевой интеграции в хромосому. Вместе с ранее разработанными векторами pDUAL экспрессия трех трансгенов в прототрофных трансформантах теперь доступна без использования устойчивых к лекарствам маркеров.